龍膽為龍膽科植物（wù）條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、龍膽G.scabra Bunge、三（sān）花龍膽G.triflora Pall.或堅龍膽G.rigescens Franch. 的（de）幹操根及根莖，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，主治濕熱黃（huáng）疽、陰腫陰癢、帶下、強中、濕疹搔癢、目赤等症。龍膽除含有裂環環烯醚萜類和環烯萜（tiē）類化合物外，還含有（yǒu）生物堿、揮（huī）發油、多糖等成分。目前多糖提取文要采用傳統水浸提取（qǔ）法，該方法存在費時長、耗能多的（de）缺點（diǎn）。有文獻報道將超聲波應用（yòng）於對中藥苷類成分的提取中可（kě）以提高苷（gān）類的提出率並縮（suō）短提取時間。初步藥理實驗表明（míng），龍膽多糖有一定的免疫增強作用。本研究考察超聲波在龍膽多糖的提取中應用的可行性，對實驗條件進行優（yōu）化，並和傳統水提法進行比較。

1　儀器與試藥

　　UV-2102C型紫外可（kě）見（jiàn）分光光度計，尤尼柯（上海（hǎi））儀器（qì）有限公司；JP600G型超聲波提取罐，武漢嘉鵬電（diàn）子有限公司。試劑均為AR級。龍（lóng）膽藥材購自（zì）哈爾濱三棵樹藥材市場，經我院中藥鑒定室沈誌濱副教授鑒定（dìng）為條葉龍膽。

2　方法與結果

2.1　超聲波提取龍（lóng）膽多糖：稱取（qǔ）一定質量龍膽粉末，加入蒸餾水適量，分別用一定（dìng）頻率（lǜ）的超聲波超（chāo）聲處理，提（tí）取（qǔ）液濾過、濃縮、去蛋白、乙醇沉澱，得粗品多糖，真空幹燥，即得。

2.2　龍膽多糖的測（cè）定

2.2.1　葡萄糖對照品溶液的製備：精密稱（chēng）取105℃ 幹燥至恒重的葡萄糖100mg，置於100mL量瓶中，加入（rù）蒸餾水至刻度（dù），搖勻，備用。

2.2.2　龍膽多糖供試品液的（de）製備（bèi）：精密稱取幹燥至恒重的龍膽多糖23.80mg，置於（yú）100mL量（liàng）瓶（píng）中，加水溶（róng）解並稀釋至刻度，搖（yáo）勻即得。

2.2.3　苯酚（fēn）溶液的製備：取苯酚100g，加鋁片0.1 g與（yǔ）碳酸氫（qīng）鈉0.05g，蒸餾收集18℃餾分，稱（chēng）取此餾分10g，加水150g,置於棕色瓶中備用。

2.2.4 標準曲線的繪製：吸（xī）取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置（zhì）於50mL量瓶中，加入蒸餾（liú）水至刻度，搖勻。精密吸取各溶液2mL於 10mL具塞刻度試管（guǎn）中，分別加入5％苯酚溶液1 mL，搖（yáo）勻。迅速（sù）加入5mL濃硫酸（suān），振搖5min，定容（róng），置沸水（shuǐ）浴中加熱15min,然後置（zhì）冷水浴（yù）中冷卻 30min，定容，隨行空白，在490nm處測定吸光度（dù）。數據（jù）經回歸處理後（hòu），得（dé）回歸方程：A=12.886 C+0.001 5，r＝0.999 7。

2.2.5　換算因子的測定：精密量取多糖供試品溶液 0.5mL，按照“標準曲（qǔ）線的繪製”項下的方法測（cè）定吸光度值，計算（suàn）葡萄糖的（de）質量（liàng）濃度，得換算因子f= 5.418 5。

2.2.6　多糖的測定：精密稱取各樣品溶液1mL，分別置於10mL具塞刻度試管中，按照“標準曲線（xiàn）的繪製”項下（xià）方法（fǎ）測定吸光度值，按下式計（jì）算樣品中多糖的質量分數。

C·D·f

多糖（táng）=——————×100％

W

　　式中C為樣品溶液的葡萄糖的質量，D為樣品溶液的稀釋倍數，f為換算因子,W為樣品的質量（liàng） 

2.3　超（chāo）聲波法提取多搪的單因素考察

2.3.1　超聲時間對多糖提取的影響：稱取（qǔ）相同質量龍膽粉末5份，加入蒸餾水適量後分（fèn）別用一定頻（pín）率的超聲（shēng）波超聲處理（lǐ）15、30、45、60、75、90、120min, 後處理同2.1。結（jié）果見圖1。可知，超聲提取75min 時提出（chū）量很高，多糖提出率可（kě）達（dá）14.4％。而後隨著超聲時間的延長，龍（lóng）膽多糖的提取率無多大變化，並（bìng）有緩慢（màn）下降之趨（qū）勢。

圖1　提取時（shí）間對多糖得率的影晌

Fig.1 Effect of extracting time on polyssacharide yield

2.3.2 pH值對多搪（táng）提取的（de）影響：稱取相同質量龍（lóng）膽粉5份，分別加入蒸餾水適量，然後分別調節pH 為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，超聲（shēng）處理75min，後處理（lǐ）同2.1。結果見圖2,可知，超聲提取pH值為7時提取率很高，粗多糖（táng）提（tí）出率可達14.2％。

圖2　pH　值對多糖得率的（de）影晌

Fig.2 Effect of pH value on polyssacharide yield

2.3.3　加入蒸餾水量對多糖提取的影響：稱取相同質量（liàng）龍（lóng）膽粉5份，分別按藥材量與（yǔ）蒸餾水質量體積比為（wéi）1:20、1:40、1:60、1:80、1:100加入蒸餾水，超聲處理75min，後處理同2.1。結果見圖3。可知，超聲提取加入蒸餾水量（liàng）為龍膽粉：蒸餾水(1： 60)時提取率很高，粗（cū）多糖提出率（lǜ）可達14.1％。

2.4　提取條（tiáo）件的優化：在單因（yīn）素考察的基礎上，稱取相同質（zhì）量的龍膽粉9份（fèn），分置於9個燒（shāo）杯中，選（xuǎn）用 L9<34）正交表進行（háng）優化，結果見表1。正（zhèng）交實驗結果（guǒ）表明在龍膽粉末中加入（rù）60體積的水（shuǐ），在pH 7.0的條件下用超（chāo）聲波提取75min得到的龍（lóng）膽多糖的量很（hěn）大。根據很差（chà）分析結果，影響龍膽多糖提出率的（de）3個因素中（zhōng）（pH、提取時間、加水量）以提取時間影響（xiǎng）很大，其次是加（jiā）水量，影（yǐng）響很小的是pH。

圖3　水體積對多精收率（lǜ）的影響

Fig.3 Effect of water volume on polyssacharide yield

表1 L9(34)正交優選設計及結果

Table 1 L9(34）orthogonal design and result

s

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A超聲時 B pH值 C加入蒸餾（liú） D 多糖

試驗號 間/min 水量/倍 (空白) /%

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1 1(60) 1(6.0) 1(40) 1 1452

2 1 2(7.0) 2(60) 2 1737

3 1 3(8.0) 3(80) 3 1581

4 2(75) 1 2 3 1560

5 2 2 3 1 1481

6 2 3 1 2 1392

7 3(90) 1 3 2 1492

8 3 2 1 3 1429

9 3 3 2 1 1385

K1 0.4770 0.4504 0.4273

K2 0.4433 0.4647 0.4682

K3 0.4306 0.4358 0.4554

k1 0.1590 0.1501 0.1424

k2 0.1478 0.1549 0.1561

k3 0.1435 0.1453 0.1518

R 0.0155 0.0096 0.0137

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2.5　傳統方法提取與精製龍膽多糖：將幹燥粉碎後的（de）龍（lóng）膽生藥樣品稱取100g,用500mL石油醚回流脫脂2次（cì），每次（cì）1h。回收石油（yóu）醚，藥渣揮幹溶劑後用（yòng） 80％乙醇（chún）500mL浸（jìn）漬過夜，回流提取2次，每次 2h。濾過，將藥渣用2500mL蒸餾水90℃溫浸提取60min，再用500mL蒸餾水（shuǐ）90℃重複溫浸提取 60min，濾過，合並（bìng）濾液。將此溶液減壓（yā）濃縮至200 mL用氯仿萃取多（duō）次以除去蛋白（bái）質，再加1％活性炭脫色2次，濾過（guò），濾液加入95％乙醇使乙醇（chún）的體積分數達到80％，靜置過夜，殘渣（zhā）依次用95％乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，真空幹燥，得精製龍膽多糖。與超聲提取的結果（guǒ）比較，見表2。

3　討論

3.1 超聲波（bō）法提取龍（lóng）膽多糖（táng）時，超聲時間不宜過

表2　兩種提取方法結果（guǒ）比較（jiào）(n=5)

Table 2 Comparison of two extracting methods(n=5)

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方法（fǎ）　 粗多糖/g 提取率（lǜ）/% 多糖/%

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水提（tí）　0.152±0.021 15.20±2.10 19.80±1.57

超聲 0.168±0.022 16.80±2.20* 28.19±1.52**

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與水（shuǐ）提相比較（jiào）：*P＞0.05 **P＜0.05

*P＞0.05 **P＜0.05 vs water extracting 長。超聲（shēng）處理75min時提取率達到（dào）很大，隨著處理時間的延長，提（tí）取率反（fǎn）而下（xià）降。原因可能是由於超聲波具有較強的剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖斷裂，從而在（zài）後處理的過程中的損失加大（dà）而影響多糖的提出率。

3.2 龍膽多糖的組（zǔ）成十（shí）分複雜，由（yóu）多種單糖組成。目前常（cháng）用的測定方法是蒽（ēn）酮-硫酸比色（sè）法和苯酚- 硫酸比色法。但在實際工（gōng）作中，特別是在（zài）測定天然產物中的糖測定時，測得的結果（guǒ）與實（shí）際情（qíng）況不符。原因是這兩種方法都是以葡萄糖作為（wéi）對照，這對含有多種單糖的天然多糖來說必（bì）將使測量值與實際值不（bú）符。本實（shí）驗中有將近70％的產物未被檢出，這是在多糖測定方法的研究中（zhōng）經常遇到（dào）的問題。如果在製作標準曲線時能夠（gòu）根據多糖的組（zǔ）成，用多種單糖適當混合後作為對照，就可（kě）以在一定程度上改善這種情況。

3.3 植物多糖作為免疫增強劑已引起人們的廣泛關注，臨床用於腫瘤（liú）病人的治療已取（qǔ）得（dé）較好療效（xiào）。龍膽多糖可否作為免疫增（zēng）強藥（yào）物應進一步深入（rù）研究（jiū）。 （中草藥第36卷（juàn）第6期 江蔚新，朱正蘭）

　　產品型號：JP600G型超聲波提取/乳（rǔ）化機組

　　機型結構：超聲波發生器與（yǔ）提取罐分體式

　　超（chāo）聲頻率：28KHz

　　超聲峰值功率：1000W （由原600W升級至1000W，價格不變）

　　提取罐內尺寸（cùn）：直徑320 ×高250mm

　　提取罐容積：小於等於20L

　　攪拌電機功率：15W

　　攪拌電機轉速：10-30轉/min（可調）

　　電加熱功率：2KW

　　供電（diàn）電源：220VAC 50HZ 

　　具有數顯時鍾可調（diào）功能

　　具有數顯功率可調功（gōng）能

　　具有數顯（xiǎn）掃頻可調功能

　　具有（yǒu）數顯溫度可調功能

　　武（wǔ）漢嘉（jiā）鵬電子（zǐ）有限公司專業致力於超（chāo）聲波提（tí）取/萃取、超聲波乳化、超聲波清洗、超聲波汙水處理、超聲波酒類醇化產品的（de）研發、生產（chǎn）及銷售。公司擁有多項技術。其中“數字式大功率多用途超聲波電源（yuán）係統”獲武漢市重大科技成果獎。數字（zì）掃頻實現了用戶迫切需（xū）要的變頻要求的同時還彌補了早期雙頻或多頻（pín）技術帶來的超聲轉（zhuǎn）換效率很（hěn）低的弊端。此項技術（shù）經由全國各大院校的用戶使用後反應很好。應用於植物提取（qǔ）、乳化、汙水處理等領域，院校包括（kuò）：清華大學、北京大學、浙江大學（xué）、華中科技大學、武漢大學、華中師大、中國地質大學、武漢科（kē）技大學（xué）、上海交大、浙江工業大學、蘭州大（dà）學、河南農業大學、武漢化工學院、吉林大學、四川大學、華南理（lǐ）工大學、華東理工大學、江漢大學、長江大學（xué）、中（zhōng）科（kē）院武漢植（zhí）物（wù）所、昆明植物所、中科院過程所、中科院（yuàn）武漢物理所、武（wǔ）漢市藥檢所等。公司產品行銷全（quán）國除港、澳、台外的所有省份及直轄市。售後方麵：公司產品使（shǐ）用自主技術故性能穩定、質量很好。公司承諾5年內免費質保。用戶采用超聲波需注意的事項：超聲波提取方麵：一、被提取物需粉碎到20目或更細。粉碎越細得率越高。二、選用（yòng）合適的提取溶劑。三、根據產品的特性和產（chǎn）量合理的安排提取工藝。

　　超（chāo）聲波乳化方麵：一、乳化液的配方包括乳化劑的用量。二、乳化時間的（de）選定，並不是時間長就（jiù）越好，乳化過程是分散和聚合不停的循環的過程（chéng）。按現有試驗結果顯示10－15分（fèn）鍾的乳化粒徑可達100納米。

　　重要的是數字掃頻的選擇，此項共有16檔選擇，數值越低則氣泡越粗、力量越大；數值（zhí）越高（gāo）則氣泡越細、力量越小（xiǎo）。不同的提取或（huò）乳化物質改（gǎi）變數字掃頻會帶來不同的效果及效率。

　　超聲波提取天然產物包括超聲波提取多肽、氨基酸、核酸、各種酶類、單糖、寡糖、多（duō）糖、糖（táng）蛋白、樹脂（zhī）、膠體物（wù）、木質（zhì）素、維生素、脂（zhī）肪、油脂、蠟、生物堿、揮發油、黃酮、糖苷類、苯丙素類、有機（jī）酸、酚（fēn）類（lèi）、醌類、甾（zāi）體化合物、抗生素類等。